针对于样品DNA总量很少,但无法再次通过样品抽提获得更多DNA的情况下,我们可以通过全基因组扩增技术来增加DNA的总量,使实验研究可以持续进行。
技术方法:
全基因组扩增(whole genome amplification,WGA)是一种对全基因组序列进行非选择性扩增的技术,其目的是在没有序列倾向性的前提下大幅度增加DNA的总量。本公司拥有自主知识产权的全基因组扩增试剂盒(AmpAll®),该试剂盒主要 利用一种特殊聚合酶,在恒温下,采用超分支扩增模式(图一),从少量DNA样本中均匀、地扩增全基因组DNA,实现对样本全基因组DNA的高产量和高质量的均匀扩增。该聚合酶具有与模板很强的结合能力,能在结合的模板上连续延伸70kb以上,同时,这种酶具有3’ —5’外切酶活性,错误率仅为5 x 10-6,大约比Taq DNA聚合酶低100倍,这保证了序列扩增的高保真性。 用该试剂盒进行的全基因组扩增主要具有以下几个优点: ●高产量: 10ng (甚至小于1ng) 基因组DNA经扩增后可产生 >15µg (20µl 反应体系) 或 >35 µg(50µl 反应体系) 的DNA产物,因此扩增倍数可达上万倍。 ●高质量: 1)全基因组扩增后的产物长度可达100kb, 平均长度>10kb (见图二), 所以该产物可用于克隆,单倍型确定以及长片断PCR等实验。 2)当用于扩增的DNA模板达到一定量时(基因组DNA >10ng 或细胞数>600个),不同基因位点的扩增效率相当一致,因此扩增覆盖率可接近100%。 3)该试剂盒用的是高保真DNA聚合酶,在扩增过程中,碱基突变引入或短串联重复序列(STR)复制滑移发生的概率非常低,因此该扩增产物完全可用于后续的DNA分析如测序,SNP和STR分型等。 图一,超分支扩增模式示意图。首先随机引物(橙色)在多个位点与模板DNA(黑色)配对, DNA聚合酶随后在这些位点上同时开始延伸。在延伸过程中碰到有互补链存在时,该聚合酶将该互补链解离模板继续延伸。被解离的互补链是单链,可以作为新的模板来扩增。这样,一段长DNA模板在随机引物和聚合酶作用下不断分叉产生新的单链模板,形成一个超分支结构的巨大复制单元,从而使得该模板不断得到扩增,产生大量高分子量的DNA. 应用领域: 该方法涉及到分子生物学和基因组学的几乎所有实验研究领域。
样本要求:
基因组DNA, 新鲜或干燥的全血,口腔粘膜刮液,发根和培养的细胞都可用该试剂盒进行全基因组扩增。样本用量很少,基因组DNA 5ng即可, 但考虑到DNA定量的偏差或DNA质量的样本间差异等可能影响扩增一致性的因素,建议用量>20ng,且。每个反应的模板DNA用量最好大于20ng,模板DNA不能严重降解,以减少因模板量太少而造成等位基因的不平衡扩增。 服务内容:
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检测实例:
图二, 不同样品的全基因组扩增情况。M 是标准分子量DNA,1是0.1ng DNA,2是1ng DNA, 3是10ng DNA,4是一根发根,5是口腔粘膜刮液,6是0.2 µl 新鲜血样。 |