技术参数与实验流程
*****************************************************************
 
技术参数

样本要求	测序策略	数据要求
样品类型：完整无DNA污染的Total RNA； 样本起始量 (单次)：≥ 3 μg /样本； 样本浓度：建议介于≥ 50 ng/μL； 样本纯度：OD260/280 ≥ 1.8；28S/18S ≥ 1.5； 样本完整度：2100 Bioanalyzer RIN值 ≥ 8.0；	Hiseq 2×150	Q30>80% rRNA比例低于rawdata 的3% 单个样本数据量可为3/5/10G，根据客户需求选择

经典文章解读
*******************************************************************
案例：早期发育的玉米种子胚与胚乳的差异转录网络

背景：玉米是世界上最重要的粮食作物，玉米种子的发育开始于双受精，双受精后由合子发育成胚，中央细胞发育成胚乳。胚乳的主要功能是提供为胚的萌发和发育提供营养。目前，一个完整的胚和胚乳的转录谱仍然缺乏。胚和胚乳的转录组分析可以从本质上了解这两种组织的发育过程。

方法：研究人员收集了授粉后9天的玉米胚乳和胚，然后进行mRNA-seq，预测了新的转录区域、选择性剪切、反式剪切；并通过RT-PCR验证转录本和反式剪切事件的准确性；然后进行了胚乳和胚差异表达基因分析，GO分析，聚类分析；并对转录因子及其它转录调控元件进行分析。

结果：

• 预测新的转录本


•         •  68.1%，28.8%，3.3%的reads分别可以比对到外显子，结合区以及基因间隔区。RNA-seq测到的剪接位点和外显子有一部分是和注释是不重叠的，说明存在新的转录本。
•         •  通过新方法鉴定1286个新转录区域，这些新转录区域与有注释的转录本相比，具有更少的外显子，并且新转录本的长度是有注释的转录本的一半，虽然和有注释的转录本的表达量相差不多，但是这些新转录区域的表达在胚和胚乳中是相差很大的。
•         •  通过RNA-seq数据预测到一个新转录区域含有9个转录本，其中5个转录本只在胚中存在，另外4个转录本只在胚乳中存在。另外这两大类转录本主要在两个结合区有明显区别。
•         •  通过RT-PCR对这些新转录区域进行了验证，实验表明大部分新转录区域都可以通过RT-PCR 验证到。

• 预测新的选择性剪切


•         •  发现50.7% 的多外显子基因存在选择性剪切，并且不同转录本有组织特异性。
•         •  通过计算分析，存在8种不同的选择性剪切方式， 其中Retained intron 是主要方式，并且这些剪切方式在胚的数目是要比在胚中多，预示选择性剪切在种子发育过程中非常重要。
•         •  通过计算，发现有9个染色体内的反式剪切，37个染色体间的反式剪切。在染色体内的剪切中，有一部分来自相邻的基因剪切，还有一部分来自遥远的基因剪切。这些不同的反式剪切方式在胚乳和胚中是不同的。通过RT-PCR对这些反式剪切转录本进行了验证，证明了RNA-seq结果是可靠的。

• 胚乳和胚差异表达基因分析，GO分析，聚类分析


•         •  发现在胚中表达的基因数目要多于胚乳。共鉴定到2982个在胚和胚乳中差异表达的基因，其中在胚乳中上调的基因主要参与储存营养，储存能量以及碳水化合物的基因编码。而在胚中上调的基因主要参与染色质调控，核小体组装，DNA的包装和转录调控等生物过程。

• 转录因子及其它转录调控元件的分析


•         •  937个转录因子在胚和胚乳中呈现特异性表达，在胚中高表达的转录因子具有各种各样的功能，例如参与表观遗传，跨代编辑，细胞分化，激素信号转导，细胞命运决定等。
•         •  另外发现了参与小RNA途径的调控元件，例如DCL，AGO在胚中是高表达的，预示着小RNA途径对胚的发育非常重要。

经典文章解读
Lu X ., et al., The Differential Transcription Network between Embryo and Endosperm in the Early Developing Maize Seed..Plant Physiol, 2013 May;162(1):440-55.